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反相色譜柱的選擇和使用

發(fā)布時(shí)間:2015.09.16 閱讀量:1638

液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以硅膠為柱,或是在硅膠表面鍵合-CN,-NH3等官能團(tuán)的鍵合相硅膠柱;反相柱填料主要以硅膠為基質(zhì),在其表面鍵合非極性的十八烷基官能團(tuán)(ODS)稱為C18柱,其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱,GPC柱,聚合物填料柱等。

反相色譜柱的選擇

1. 柱子的PH值使用范圍
反相柱優(yōu)點(diǎn)是固定相穩(wěn)定,應(yīng)用廣泛,可使用多種溶劑。但硅膠為基質(zhì)的填料,使用時(shí)一定要注意流動(dòng)相的PH范圍。一般的C18柱PH值范圍都在2-8,流動(dòng)相的PH值小于2時(shí),會(huì)導(dǎo)致鍵合相的水解;當(dāng)PH值大于7時(shí)硅膠易溶解;經(jīng)常使用緩沖液固定相要降解。一旦發(fā)生上述情況,色譜柱人口處會(huì)塌陷。同樣填料各種不同牌號(hào)的色譜柱不盡相同。如果流動(dòng)相PH較高或經(jīng)常使用緩沖液時(shí),建議選擇PH范圍大的柱子,例如戴安公司的Acclaim柱PH 2-9或Zorbax的PH 2-11.5的柱子。


2. 填料的端基封尾(或稱封口)
把填料的殘余硅羥基采用封口技術(shù)進(jìn)行端基封尾,可改善對極性化合物的吸附或拖尾;含碳量增高了,有利于不易保留化合物的分離;填料穩(wěn)定性好了,組分的保留時(shí)間重現(xiàn)性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物,最好選用填料經(jīng)端基封尾的色譜柱。

液相色譜柱的使用

色譜柱在使用前,最好進(jìn)行柱的性能測試,并將結(jié)果保存起來,作為今后評價(jià)柱性能變化的參考。在做柱性能測試時(shí)要按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行(出廠測試所使用的條件是最佳條件),只有這樣,測得的結(jié)果才有可比性。但要注意:柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同。

1、樣品的前處理


a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。


b、使用預(yù)處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。


c、使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質(zhì)。

2、流動(dòng)相的配制


液相色譜是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的,因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn):


a、流動(dòng)相對樣品具有一定的溶解能力,保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中(或長時(shí)間保留在柱中)。


b、流動(dòng)相與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。


c、流動(dòng)相的黏度要盡量小,以便得到好的分離效果;降低柱壓降,延長泵的使用壽命(可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度)。


d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測器相適應(yīng)。如使用UV檢測器,最好使用對紫外吸收較低的溶劑配制。


e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低,否則容易產(chǎn)生氣泡,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法進(jìn)行。


f、在流動(dòng)相配制好后,一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測,還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。


3、流動(dòng)相流速的選擇


因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù),使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱,要追求最佳柱效,最好使用最佳流速。對內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱,流速一般選擇1ml/min,對于內(nèi)徑為4.0mm柱,流速0.8ml/min為佳。


當(dāng)選用最佳流速時(shí),分析時(shí)間可能延長??刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間(如使用反相柱時(shí),可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。


注意:


a.含水流動(dòng)相最好在實(shí)驗(yàn)前配制,尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過夜。最好加入疊氮化鈉,防止細(xì)菌生長。


b.流動(dòng)相要求使用0.45 μm濾膜過濾,除去微粒雜質(zhì)。


c.使用HPLC級溶劑配制流動(dòng)相,使用合適的流動(dòng)相可延長色譜柱的使用壽命,提高柱性能。


色譜柱的維護(hù)


1. 色譜柱的平衡


反相色譜柱由工廠測試后是保存在乙腈/水中的。新柱應(yīng)先使用10-20倍柱體積的甲醇或乙腈沖洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動(dòng)相和乙腈/水互溶。每天用足夠的時(shí)間以流動(dòng)相來平衡色譜柱,您就會(huì)在處理問題方面獲得最大的"補(bǔ)償",而且您的色譜柱的壽命也會(huì)變得更長!操作步驟:


a. 平衡開始時(shí)將流速緩慢地提高,用流動(dòng)相平衡色譜柱直到獲得穩(wěn)定的基線(緩沖鹽或離子對試劑流速如果較低,則需要較長的時(shí)間來平衡)


b. 如果使用的流動(dòng)相中含有緩沖鹽,應(yīng)注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水沖洗30分鐘以上再用緩沖鹽流動(dòng)相平衡; 分析結(jié)束后必須先用純水沖洗30分鐘以上除去緩沖鹽之后再用甲醇沖洗30分鐘保護(hù)柱子。


2. 色譜柱的再生


長期使用的色譜柱,往往柱效會(huì)下降(柱子的理論塔板數(shù)減低)??梢詫ιV柱進(jìn)行再生,在有條件的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)使用一個(gè)廉價(jià)的泵進(jìn)行柱子的再生。
建議用來沖洗柱子的溶劑體積
色譜柱尺寸柱體積所用溶劑的體積
125-4mm 1.6ml 30ml
250-4 mm 3.2ml 60ml
250-10mm 20ml 400ml


選擇再生方法:


極性固定相(如Si,NH2* ,DIOL基色譜填料)的再生:
正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非極性固定相(如反相色譜填料RP-18,RP-8,CN等)的再生:水→乙腈→氯仿(或異丙醇)→乙腈→水


注意:

a.在對NH2改性的色譜柱進(jìn)行再生時(shí),由于NH2可能以銨根離子的形式存在,因此應(yīng)該在水洗后用0.1M的氨水沖洗,然后再用水沖洗至堿溶液完全流出。


b.0.05M稀硫酸可以用來清洗已污染的色譜柱,如果簡單的用有機(jī)溶劑/水的處理不能夠完全洗去硅膠表面吸附的雜質(zhì),在水洗后加用0.05M稀硫酸沖洗非常有效。


3. 色譜柱的維護(hù)


a.使用預(yù)柱保護(hù)分析柱(硅膠在極性流動(dòng)相/離子性流動(dòng)相中有一定的溶解度)


b.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2-7.5,盡量不超過該色譜柱的pH范圍


c.避免流動(dòng)相組成及極性的劇烈變化


d.流動(dòng)相使用前必須經(jīng)脫氣和過濾處理


e.如果使用極性或離子性的緩沖溶液作流動(dòng)相,應(yīng)在實(shí)驗(yàn)完畢柱子沖洗干凈,并保存于甲醇或乙腈中


f.氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性,故使用時(shí)要注意,柱及連接管內(nèi)不能長時(shí)間存留此類溶劑,以避免腐蝕。


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